Étudier une protéine, ce n'est pas seulement connaître sa séquence. En biochimie, on cherche souvent à répondre à plusieurs questions très concrètes : où est cette protéine ?, quelle est sa masse ?, quelle est sa charge ?, est-elle présente dans un échantillon ?, avec quoi interagit-elle ?, ou encore quelle est son identité moléculaire ?

Le problème de départ est toujours le même : une cellule contient des milliers de protéines différentes, mélangées à des lipides, des glucides, des acides nucléiques et des petites molécules. Les techniques d'étude des protéines servent donc à extraire, séparer, purifier, visualiser, identifier et parfois quantifier une protéine d'intérêt.

Dans ce cours, l'objectif n'est pas de devenir technicien de laboratoire, mais de comprendre la logique des grandes méthodes. Chaque technique repose sur une propriété physico-chimique des protéines : leur taille, leur charge, leur forme, leur affinité pour un ligand, leur masse moléculaire, ou leur capacité à être reconnue par un anticorps spécifique.

Avant d'analyser une protéine, il faut d'abord la faire sortir de son environnement biologique. Si la protéine est intracellulaire, elle est enfermée dans une cellule ; si elle est mitochondriale, nucléaire ou membranaire, elle est même associée à un compartiment précis. La première étape est donc l'extraction, c'est-à-dire l'obtention d'un mélange contenant la protéine d'intérêt.

L'extraction commence en général par une lyse cellulaire. Lyser une cellule signifie rompre sa membrane plasmique pour libérer son contenu. Cette lyse peut être mécanique, chimique ou enzymatique. L'idée importante est qu'on veut ouvrir les cellules sans détruire la protéine étudiée : on travaille donc souvent à froid, dans un tampon adapté, avec des inhibiteurs de protéases pour éviter que les protéines ne soient dégradées.

Une fois les cellules lysées, on obtient un mélange très complexe appelé lysat cellulaire. Ce lysat contient des fragments de membrane, des organites, des protéines solubles, de l'ADN, de l'ARN et de nombreuses autres molécules. La purification consiste alors à enrichir progressivement l'échantillon en protéine d'intérêt, en éliminant ce qui ne nous intéresse pas.

La logique générale est simple : on part d'un mélange très impur, puis on applique des étapes successives qui exploitent des différences physiques ou chimiques. Les premières étapes sont souvent assez grossières, comme la centrifugation différentielle ou la précipitation saline ; les étapes plus fines, comme la chromatographie, viennent ensuite.

La centrifugation différentielle sépare les constituants selon leur taille, leur densité et leur vitesse de sédimentation. Quand on centrifuge un lysat, les éléments les plus lourds ou les plus volumineux sédimentent plus facilement et forment un culot au fond du tube. Les éléments plus petits ou solubles restent dans le surnageant.

En pratique, on peut augmenter progressivement la vitesse de centrifugation. À faible vitesse, on récupère d'abord les noyaux et les gros débris cellulaires. À des vitesses plus élevées, on peut sédimenter des organites plus petits, comme les mitochondries, puis des membranes ou des ribosomes. Cette stratégie permet d'obtenir des fractions cellulaires enrichies, par exemple une fraction mitochondriale si l'on étudie une protéine mitochondriale.

La précipitation saline repose sur la solubilité des protéines. Les protéines sont solubles dans l'eau grâce à leurs interactions avec le solvant et avec les ions du milieu. Quand on ajoute progressivement une forte concentration de sel, par exemple du sulfate d'ammonium, certaines protéines deviennent moins solubles et précipitent. On peut alors les récupérer par centrifugation.

Cette méthode n'est pas extrêmement spécifique, mais elle est utile comme étape d'enrichissement. Elle permet de concentrer les protéines et de retirer une partie des contaminants. Le point clé est que toutes les protéines ne précipitent pas à la même concentration saline : leur solubilité dépend de leur surface, de leur charge, de leur structure et de leur environnement.

La purification n'est pas une seule technique magique. C'est une suite d'étapes qui enrichissent progressivement l'échantillon en protéine d'intérêt.

La chromatographie est une famille de techniques de séparation très utilisée pour purifier les protéines. Son principe général est de faire passer un mélange dans une colonne contenant une phase stationnaire. Les protéines interagissent plus ou moins avec cette phase stationnaire, ce qui les fait sortir de la colonne à des moments différents.

Pour comprendre l'intuition, il faut imaginer une course dans un parcours rempli d'obstacles. Certaines protéines traversent presque directement, d'autres sont ralenties parce qu'elles interagissent avec la matrice. La séparation dépend donc de la propriété exploitée par la colonne : la taille, la charge ou une interaction spécifique.

La chromatographie est une méthode de purification plus fine que la centrifugation ou la précipitation. Elle permet souvent d'obtenir une protéine très enrichie, voire presque pure, à condition de choisir la bonne stratégie. On peut enchaîner plusieurs chromatographies différentes, par exemple une première séparation par charge puis une deuxième par affinité.

Les trois chromatographies à connaître ici sont la chromatographie d'exclusion, la chromatographie d'échange d'ions et la chromatographie d'affinité. Elles ne répondent pas exactement au même besoin : l'exclusion sépare selon la taille, l'échange d'ions selon la charge, et l'affinité selon la reconnaissance d'un ligand précis.

En chromatographie d'exclusion, aussi appelée filtration sur gel, la colonne contient des billes poreuses. Les grosses protéines ne rentrent pas dans les pores et traversent donc rapidement la colonne. Les petites protéines, au contraire, entrent dans les pores, parcourent un trajet plus long et sortent plus tard. Ici, le point à retenir est donc contre-intuitif : les grosses protéines sortent en premier.

En chromatographie d'échange d'ions, la colonne porte des charges électriques. Une colonne chargée positivement retient plutôt les protéines négatives ; une colonne chargée négativement retient plutôt les protéines positives. La charge d'une protéine dépend du pH du milieu et de son point isoélectrique. On peut ensuite décrocher les protéines retenues en modifiant le pH ou en augmentant la concentration en sel.

En chromatographie d'affinité, on exploite une interaction très spécifique entre une protéine et un ligand fixé sur la colonne. Par exemple, une protéine portant une étiquette histidine peut être retenue sur une colonne contenant du nickel. Cette méthode est souvent très sélective, car seule la protéine capable de reconnaître le ligand reste fortement attachée à la colonne.

La notion d'élution désigne la sortie des molécules de la colonne. Une protéine qui interagit peu avec la phase stationnaire est éluée rapidement. Une protéine qui interagit fortement est éluée plus tard, souvent après modification des conditions expérimentales. Le profil d'élution permet de savoir dans quelles fractions la protéine d'intérêt est probablement présente.

Un exemple guidé permet de fixer les idées. Si l'on cherche à purifier une protéine recombinante portant une étiquette His-tag, on peut utiliser une chromatographie d'affinité au nickel. Les autres protéines passent dans la colonne sans être retenues. La protéine His-tag reste fixée, puis elle est éluée avec une molécule compétitrice, comme l'imidazole.

La chromatographie sépare toujours des protéines selon une propriété mesurable : taille, charge ou affinité. La question à se poser est donc : quelle propriété de ma protéine est exploitée par la colonne ?

L'électrophorèse SDS-PAGE est une technique fondamentale pour analyser des protéines. Elle permet de séparer les protéines dans un gel sous l'effet d'un champ électrique. Le gel joue le rôle d'un tamis moléculaire : les petites protéines se déplacent plus facilement que les grosses.

Le terme SDS-PAGE signifie Sodium Dodecyl Sulfate - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis. Le polyacrylamide forme le gel, tandis que le SDS est un détergent chargé négativement. Le SDS dénature les protéines, c'est-à-dire qu'il détruit en grande partie leur structure tridimensionnelle, et il les recouvre de charges négatives.

Cette étape est essentielle : sans SDS, les protéines migreraient selon un mélange de taille, de charge et de forme. Avec le SDS, la plupart des protéines ont une charge négative proportionnelle à leur longueur. Le critère principal de migration devient donc la masse moléculaire. Les petites protéines migrent plus loin dans le gel ; les grosses restent plus proches du point de dépôt.

On ajoute souvent un agent réducteur, comme le β-mercaptoéthanol ou le DTT, pour rompre les ponts disulfure. Cela permet de séparer les sous-unités d'une protéine multimérique ou les chaînes reliées par des cystéines. L'objectif est d'obtenir une séparation qui reflète surtout la taille des chaînes polypeptidiques.

Après migration, les protéines ne sont pas spontanément visibles. Il faut les colorer. Les colorations classiques incluent le bleu de Coomassie ou les colorations à l'argent. Une fois colorées, les protéines apparaissent sous forme de bandes horizontales. Chaque bande correspond à une population de protéines ayant une masse apparente proche.

La SDS-PAGE peut servir à vérifier la pureté d'une préparation. Si une purification est efficace, on s'attend à voir de moins en moins de bandes contaminantes et une bande principale correspondant à la protéine d'intérêt. Elle peut aussi aider à estimer la masse moléculaire d'une protéine en comparant sa migration à celle d'un marqueur de masse.

Un exemple simple : si une protéine purifiée est attendue à 50 kDa, on dépose l'échantillon sur SDS-PAGE avec un marqueur. Après coloration, une bande intense proche de 50 kDa suggère que la protéine est bien présente. Si plusieurs bandes apparaissent, l'échantillon contient probablement d'autres protéines, des fragments de dégradation ou des sous-unités différentes.

En SDS-PAGE, une protéine ne migre pas selon sa fonction ni selon sa charge native. Elle migre principalement selon sa masse moléculaire apparente, car le SDS impose une charge négative globale.

Toutes les électrophorèses ne sont pas dénaturantes. Dans une électrophorèse native, on cherche au contraire à conserver autant que possible la structure tridimensionnelle, les interactions entre sous-unités et parfois l'activité de la protéine. La protéine migre alors selon un ensemble de propriétés : sa taille, sa forme et surtout sa charge globale.

La différence avec la SDS-PAGE est donc majeure. En SDS-PAGE, on efface en grande partie les différences de charge et de forme pour séparer surtout selon la masse. En électrophorèse native, ces propriétés sont conservées. Deux protéines de même masse peuvent donc migrer différemment si elles n'ont pas la même charge ou la même conformation.

Pour comprendre la charge d'une protéine, il faut revenir à ses acides aminés ionisables. Selon le pH, certains groupements sont protonés ou déprotonés. Une protéine peut donc être globalement positive, négative ou neutre. Le point isoélectrique, noté pI, correspond au pH pour lequel la charge nette de la protéine est nulle.

L'isoélectrofocalisation exploite directement cette notion de pI. Les protéines migrent dans un gel contenant un gradient de pH. Tant qu'une protéine porte une charge nette, elle migre dans le champ électrique. Lorsqu'elle atteint la zone où le pH est égal à son pI, sa charge nette devient nulle : elle cesse de migrer et se focalise en une bande fine.

Le point important est que l'isoélectrofocalisation sépare les protéines selon leur pI, pas selon leur masse. Une protéine avec un pI bas est plus acide ; une protéine avec un pI élevé est plus basique. Cette séparation peut être très fine, car deux protéines proches en masse peuvent avoir des pI différents.

Cette technique est particulièrement utile dans l'électrophorèse bidimensionnelle. Dans ce cas, on sépare d'abord les protéines selon leur pI par isoélectrofocalisation, puis on les sépare dans une deuxième dimension selon leur masse par SDS-PAGE. On obtient alors une carte de taches protéiques, chaque tache correspondant à une protéine ou à une forme modifiée d'une protéine.

Un exemple permet de comprendre l'intérêt biologique. Une phosphorylation ajoute souvent une charge négative à une protéine. Cette modification peut changer son pI sans modifier fortement sa masse. L'isoélectrofocalisation peut donc révéler des formes différentes d'une même protéine, alors qu'une SDS-PAGE simple pourrait ne pas les distinguer clairement.

Si le pH est inférieur au pI, la protéine tend à être globalement positive. Si le pH est supérieur au pI, elle tend à être globalement négative.